Zsámboky Nagyszombatban született 1531-ben, de 11 éves korától külföldön élt. Vérbeli poliglott volt, állítólag 11 nyelven beszélt, de legalábbis olvasott. Előbb orvosi és bölcseleti tanulmányokat végzett, majd ifjú magyar nemesek kísérőjeként járta Európa országait és ismerkedett az ott élő tudós humanistákkal, akikkel később, már a bécsi udvari könyvtár vezetőjeként sűrűn levelezett. Ezeket az episztolákat sajnos nem sikerült hiánytalanul egybegyűjteni, amelyeket viszont ismerünk, azok plasztikusan kirajzolják írójuk sokrétű munkásságát és érdeklődését. Németországi és franciaországi stúdiumainak lezárásaként Itáliában szerzett oklevelet, majd a bolognai egyetemen tanított, sőt II. Alfonso ferrarai herceg nevelője volt egy ideig. Orvosi praxist nemigen folyatott (bár formálisan II. Rudolf udvari orvosa is volt), viszont előkelő emberekhez fűződő kapcsolatainak köszönhetően a bécsi udvarba is bejáratos lett. Megunva a vándorló életet, a császárvárosban telepedett le. Három császárt is szolgált, de különösen a legutolsó "főnöke", II. Rudolf meglehetősen félvállról vette azt a kötelességét, hogy az őt szolgáló alattvalóinak időben fizetést is illene adnia.

Zsámboky, aki nagy könyvgyűjtő volt, a saját költségén igyekezett beszerezni az udvari könyvtár számára a nem éppen olcsó nyomtatványokat és kéziratokat. Rendszeresen járta az európai könyvvásárokat, többnyire lóháton, hűséges Bombo kutyája kíséretében. Számos olyan munka első nyomtatott kiadása fűződik a nevéhez, amelyek korábban csak néhány másolatban léteztek. Zsámboky nemcsak a nyomtatás költségeit, de a kéziratok beszerzését is állta. Különösen fontos volt számára, hogy a magyar vonatkozású munkákat közkinccsé tegye. Kiadta Janus Pannonius verseit, Pietro Ransano magyar történetét, Bonfini szövegeit és Werbőczy István Tripartitumát, de Homérosz eposzait, Lukianosz és Platón dialógusait, Plautus és Horatius munkáit is ő rendezte először sajtó alá. Több átfogó történeti munkához gyűjtötte az anyagot. Többek közt Erdély történetének a megírását is tervezte, végül csak néhány magyarországi vár (Tokaj, Eger, Szigetvár) ostromának részletesebb leírására futotta az erejéből. Latinul verselő költőként is számontartották. Legismertebb műve az 1564-ben Amszterdamban kiadott Emblemata, amely még Shakespeare-re is hatással volt. Félszáz könyvnek volt a szerzője, szerkesztője, nyomdai előkészítője. A kartográfia történetében ugyancsak jegyzik a nevét. A 16. században, a korábbi munkákhoz viszonyítva az ő Magyarország-térképe volt a legteljesebb, ez a korabeli legismertebb atlaszokba is bekerült. De Ortelius nevezetes földabroszgyűjteményében helyet kapott Zsámboky Erdély-térképe és a mai Szlovéniát és Horvátországot ábrázoló Illyria-metszete is. Utolsó éveiben állandó pénzzavarral küszködött, mivel a Prágába költözött II. Rudolf nem sokat törődött a bécsi könyvtáros adósságaival, amelyekbe jobbára éppen miatta keverte magát. Özvegye csak úgy menekült meg a kilakoltatástól, hogy Zsámboky európai hírű könyv- és éremgyűjteményét a bécsi udvarra hagyta. 435 éve, 1584. június 13-án hunyt el Bécsben, nem sokkal 53. születésnapja után.